一． 蛋白样品的制备

       按组织净重（g）：裂解液体积（ml）=1:10 的比例加入相应体积的裂解液（加入终浓度为 1mM 的 PMSF，适当浓度的蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以避免内源性酶分解蛋白， 影响蛋白质的抽提）进行匀浆。

       蛋白质的样品制备是 western blotting 的第一步，也是关键步骤，要求可获得所有蛋白 质，应注意以下问题：

       （1） 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

       （2） 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价 二硫键，使其形成各自多肽的溶液。

       （3） 尽量去除核酸，多糖，脂类等分子的干扰，在裂解完毕离心之后小心取中层澄 清溶液，注意不要吸到底层沉淀和上层脂类。

       （4） 防止蛋白在处理过程中的人为修饰，制备过程必须在低温下进行，以避免细胞 破碎释放出各种酶类的修饰。（可以加入 PMSF 等酶抑制剂）

       （5） 样本制备完后分装保存，但是注意不要反复冻融

二． 凝胶的制备 

       均一胶的制备，分子量较小的蛋白选用较大浓度的凝胶。

       30%的 PAG 配置完后过滤于 4℃保存。10%SDS 室温保存。AP 不稳定，用时现配。

       制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入 10%AP 和 TEMED 至开始凝胶,时间 为 10-20min（未完全凝聚）。浓缩胶最佳聚合时间为 8-10min。可通过控制 AP 和 TEMED 量来控制。AP，TEMED 的量过高，局部胶凝的太快，会使凝胶不均匀，电泳蛋白条带会 弯曲。环境温度较高时，应减少 AP，TEMED 的量。 空气中氧气也会影响胶的聚合，所以 在分离胶上面应加一层水或正丁醇以隔绝氧气。

三． 电泳常见问题：

       （1） 条带出现“微笑”现象（中间凹两边翘起）：主要是凝胶中间部分凝固不均所致， 应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀。

       （2） 条带出现“皱眉”现象（中间鼓坡两边向下）：两玻璃板之间底部气泡所致，应 排除底部气泡。

       （3） 带出现拖尾现象：主要是样本溶解效果不佳；分离胶浓度过大，电泳缓冲液放置时间过长。建议：加样前离心，选择适当的样本缓冲液，加适量的样品促溶 剂；使用新配置的电泳缓冲液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶。

       （4） 蛋白条带出现纹理现象：样品不溶性颗粒引起的。建议：加样前离心，加入适 量的促溶剂。

       （5） 指示的溴酚蓝已跑出底板，但蛋白质未跑下来：与缓冲液和分离胶的浓度有关。 应更换正确 PH 值的缓冲液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶

四． 转印

       湿式电转印注意事项：

       （1） 要使蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上，缓冲液的 PH 值很重要。 有些分子量不是很大的蛋白质区带，即使延长电转印时间也不能从凝胶转移到 膜上。这是由于蛋白质在转移缓冲液中恰好处于等电点状态造成的，因此应适 当改变转移缓冲液的 PH，以利于转膜。另外，对于分子量较小的蛋白质，可 在缓冲液中加入适量甲醇，因为甲醇能促进它们固定在固相膜上。但是对于大 分子量的蛋白质，尤其是碱性蛋白质，缓冲液中是不宜加入甲醇的，因为甲醇 使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白的转移，甲醇能将结合在碱性蛋白 质上的 SDS 解离出来而使其带正电或呈电中性，蛋白质就更难从凝胶中转移出 来。

       （2） 电转印膜的选择：有 NC 膜，重氮化膜和阳离子尼龙膜，PVDF 膜。其中 NC 膜使用的最为普遍，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它 与蛋白质的结合是非共价性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔径大小也是考虑的 重要因素，目的蛋白 30KD 以下用 0.22um 孔径的 NC 膜，30KD 以上用 0.45um 孔径的 NC 膜。

       （3） 转印选择恒流，每个转印槽 150mA,10KD 以下转印 40min，10-30kd 转印 50min， 30-100KD 转印 70min，100kd 以上转印 80min，转印完毕可用丽春红 S 染膜， 检测转印是否成功，转印结束后，去除 NC 膜置于丽春红 S 溶液中，室温 5-10min 即可看见红色条带，用 TBS 洗数次即可洗掉红色条带进行后续实验。

五． 封闭

       （1） 电泳转膜过后，膜上其他没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭， 以避免一抗或二抗非特异性结合。这是由于 WB 的灵敏度很大程度上取决于封闭的好坏，封闭时间过长（过度封闭）导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵 敏度；封闭时间过短（不完全封闭）又会导致最终背景增高或信噪比太低，因 此封闭液的选择和条件的优化很重要。

       （2） 封闭液中应加入适量的防腐剂，避免封闭蛋白变性影响封闭效果。

六． 抗体的杂交

       （1） 若非特异性条带过多，可适当降低抗体的浓度，增加洗膜次数，蛋白电泳前延 长变性时间，减少上样蛋白量，延长封闭时间。

       （2） 若信号弱，可能转膜不完全，可优化转移时间和电流，增加抗体的浓度，适当 延长曝光时间。

       （3） 若背景较高，可适当降低抗体的浓度，过滤二抗，延长封闭时间，增加漂洗时 间，减少曝光时间。

七． 检测

       （1） 胶片曝光几秒到数分钟，具体情况要看膜上化学发光条带明暗强度而定。胶片 曝光时间不宜过长，时间过长会照成胶片背景变深。冲洗胶片以确定所测抗原 的正确曝光时间。

       （2） 冲洗胶片的步骤：曝光完的胶片先在显影液中冲洗至出现条带为止，一般在 1min 以内，时间过长也会照成胶片背景变深。再放入定影液中漂洗，十秒即可。 显影液漂洗完后，要多用清水冲洗，以免定影液中成分残留在胶片上。